UJI KUANTITATIF PROTEIN Biokimia

UJI KUANTITATIF PROTEIN Biokimia. Kata protein berasal dari kata protos atau proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang terdapat pada makanan berfungsi untuk zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Kita memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan.

Baca juga: Cara Uji Kadar Protein Metode Kjeldhal

Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebut protein nabati. Beberapa makanan sumber protein ialah daging, telur, susu, ikan, beras, kacang, kedelai, gandum, jagung, dan buah-buahan. Tumbuhan membentuk protein dari CO2, H2O, dan senyawa nitrogen.

Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani. Disamping digunakan untuk pembentukan sel-sel tubuh, protein juga dapat digunakan sebagai sumber energi apabila tubuh kita kekurangan karbohidrat dan lemak (Wulandari, 2005).

Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai bobot molekul yang sangat bervariasi dari lima ribu hingga lebih satu juta. Disamping berat molekul yang berbeda-beda, protein mempnyai sifat yang berbeda-beda pula.

Sifat Protein

Ada protein yang mudah larut dalam air dan ada juga protein yang tidak larut dalam air, contohnya rambut dan kuku. Protein tersebut tidak mudah bereaksi sedangkan protein yang mudah larut dalam air dan mudah bereaksi contohnya bagian putih telur (Poedjiadi, 2007 : 109).

Protein mempunyai massa molar yang tinggi, mulai dari sekitar 5000 g sampai 1 x 10⁷ g, tetapi persen komposisi berdasarkan massa dari unsur-unsur di dalam protein ternyata konstan yaitu karbon 50% – 55% ; hidrogen 7% ; oksigen 23% ; nitrogen 16% ; dan sulfur 1%. Struktur protein biasanya dibagi menjadi empat tingkat organisasi.

Struktur primer adalah sebutan untuk urutan asam amino khas dari rantai polipeptida. Struktur sekundermeliputi bagian-bagian dari rantai polipeptida yang distabilkan oleh suatu pola teratur dari ikatan-ikatan hidrogen antara gugus CO dan gugus NH dari tulang punggung, misalnya α-heliks. Istilah struktur tersier berlaku pada struktur tiga dimensi yang distabilkan oleh gaya dispersi, ikatan hidrogen, dan gaya antarmolekul lainnya.

Struktur tersier berbeda struktur sekunder karena asam amino yang mengambil bagian dalam interaksi ini mungkin jaraknya berjauhan dalam rantai polipeptida. Jadi, selain berbagai interaksi di dalam rantai yang menghasilkan struktur sekunder dan tersier, kita juga harus mempertimbangkan interaksi di antara rantai. Susunan keseluruhan rantai polipeptida dinamakan struktur kuaterner (Chang, 2005 : 295).

Konsep Ideal Protein

Konsep ideal protein dapat dikembangkan dalam penyusunan ransum walaupun berbeda jenis kelamin, berat maupun genetic.

Konsep ideal protein didasarkan pada relative asam amino yang dibutuhkan oleh ternak untuk pertumbuhan dan pemeliharaan, dimana kebutuhan dari asam amino tersebut akan berbeda menurut jenis kelamain, umur, berat dan juga genetik dari ternak, namun perbandingan antara asam amino esensial selalu sama.

Dalam menentukan konsep ideal protein, asam amino lisin digunakan sebagai sebagai referansi dari asam amino lainnya. Ada beberapa alasan mengapa asam amino lisin digunakan sebagai referensi yaitu :

1). dalam pakan ternak, lisin merupakan faktor pembatas kedua setelah asam amino sulfur (methionin) dan threonin,

2). lisin dapat dianalisis langsung

3). Lisin digunakan langsung untuk produksi dan maintenen (tidak digunakan sebagai precursor), dan

4). Data kebutuhan lisin dalam berbagai jenis pakan, kondisi lingkungan dan komposisi tubuh ternak telah tersedia lengkap. Sehingga mudah untuk digunakan sebagai dasar untuk menghitung kebutuhan asam amino esensial lainnya (Baker, 2009 : 29).

Analisa Protein

Analisa protein dilakukan dengan beberapa cara yaitu:

1) Analisa kualitatif : Test  Biuret, Test Molish, Test Xanthoprotein, Test Millon, Test Ninhidrin ; dan

2) Analisa kuantitatif : Metode Dumas, Spektrofotometri UV, Titrasi formol, Turbidimetri atau kekeruhan, Metode Kjeldahl yang terbagi menjadi 3 tahap, yaitu destruksi, destilasi dan titrasi.

Spektrofotometer UV-Vis merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra violet (UV) dan sinar tampak (visible). Alat ini digunakan untuk mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam suatu larutan. Konsentrasi larutanyang dianalisis sebandingdengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Dalam hal in hokum Lamber Beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan tersebut. Dibawah ini adalah persamaan Lamber Beer :

A = -log T = ε b c

dengan A = absorban, T = transmitan, ε = absortivitas molar, p = panjang kolom, dan c merupakan konsentrasi zat (Daintith, 2004 : 79).

Spektrofotometer UV-Vis merupakan alat yang digunakan dalam analisis kolorimetri, salah satunya untuk penentuan kadar ion logam dalam sampel padatan maupun cairan. Kolorimetri merupakan suatu teknik analisis kuantitatif untuk sampel berwarna, yang digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu zat berdasarkan intensitas cahaya warna larutan. Suatu larutan direaksikan dengan larutan lain dan menghasilkan larutan senyawa kompleks yang berwarna.Dari warna larutan kompleks yang dihasilkan maka absorbansinya dapat diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Warna yang diukur oleh spektrofotometer UV-Vis adalah warna komplementer dari senyawa kompleks (Rusmawan, 2011).

Molekul zat warna merupakan gabungan dari zat organik yang tidak jenuh, khromofor sebagai pembawa warna dan auksokrom sebagai pengikat antara warna dengan serat. Gugus khromofor seperti gugus azo, nitroso, nitro dan gugus karbonil, sedang gugus auksokorom seperti golongan kation dan anion.  Zat warna alam (zwa) adalah zat warna yang ramah lingkungan, tidak berbahaya bagi pelaku maupun pengguna, dan warnanya lebih beragam. Ekstrak daun mangga adalah jenis zwa yang diperoleh dari hasil ekstraksi daun mangga (Mangifera indica LINN) pada proses perebusan.Zat warna alam pada umumnya termasuk zat warna beits (mordant-dyes) dan beberapa termasuk zat warna bangkitan, seperti alizarin, logwood, weld dan fustic dapat mencelup/mewarnai apabila bahannya dimordan terlebih dahulu dengan khromhidroksida, timbal atau aluminium. Proses mordan bergantung pada kenyataan bahwa sejumlah elemen logam dapat berfungsi sebagai penerima (aseptor) terhadap pemberi elektron (donor) untuk membentuk ikatan koordinat atau semi polar (Suheryanto, 2010).

Kuantisasi dari total kandungan protein dalam sampel merupakan langkah penting dalam analisis protein. Spektroskopi UV-Vis serapan molekul sangat efisien dalam analisis kuantitatif seperti kuantisasi protein dan memiliki aplikasi luas dalam kimia dan laboratorium klinis di seluruh dunia. Diantara berbagai teknik untuk pengujian protein, uji biuret adalah kepentingan tertentu dalam penelitian ini. Penelitian ini berusaha untuk memverifikasi sensitivitas uji biuret untuk sampel untuk sampel protein dengan konsentrasi mulai 0,01-5 mg/mL. Telur ayam albumin digunakan sebagai sampel protein. Uji ini dinilai untuk menentukan kisaran konsentrasi di mana ia akan menunjukkan linearitas. Tes biuret dipamerkan linearitas dalam berbagai konsentrasi (0,1000 ± 0,004-5,00 ± 0,02 mg/mL). Mulai rentang konsentrasi protein yang didirikan untuk kurva kalibrasi pengujian ini lebih rendah dari nilai literatur yang ditemukan (1 mg/mL sampel) (Janairo, 2011).

Support Vector Machine (SVM) digunakan untuk memprediksi struktur protein. Bioinformatika menggunakan metode prediksi sturktur sebagian besar tergantung pada urutan asam amino. Dalam tulisan ini, pekerjaan diperkirakan dari 1D, 2-D, dan 3-D prediksi struktur protein. Prediksi struktur protein adalah salah satu masalah yang paling penting dalam perhitungan biologi modern. Support Vector Machine (SVM) kaya menunjukkan kemampuan generalisasi prediksi struktur protein yang kuat. Teknik klasifikasi biner SVM diimplementasikan dan fungsi RBF kernel yang digunakan dalam SVM. Fungsi ini Radial Dasar (RBF) dari SVM menghasilkan akurasi yang lebih baik dalam hal klasifikasi dan hasil pembelajaran (Mandle, 2012).

Uji Kuantitatif Protein

1.      Alat-alat Praktikum

a.         Spektrofotometer UV-Vis

b.        Tabung reaksi

c.         Pipet tetes

d.        Kuvet

e.         Mikro pipet

2.      Bahan-bahan Praktikum

a.         Sampel protein

b.        Standar protein

c.         Larutan CuSO4 1 %

d.        Larutan NaOH 10 %

e.         Aquades

f.         Es batu

Skema Kerja Kuantitatif Protein Biokimia

1. Persiapan Larutan standar

5 mL larutan standar protein 0,5 mg/mL· Dimasukkan ke dalam tabung reaksi, + 1 mL CuSO₄1 %, + 1 mL NaOH 10 %, + 1 mL aquades

Diulang langkah di atas untuk larutan standar 1, 2 dan 4 mg/ml

2. Preparasi Larutan Sampel

5 mL larutan sampel A dan sampel, Dimasukkan ke dalam tabung reaksi, + 1 mL CuSO₄1 %, + 1 mL NaOH 10 %, + 1 mL aquades

3. Preparasi Larutan Blanko

Dalam Tabung Reaksi, + 1 mL CuSO₄ 1 %, + 1 mL NaOH 10 %, + 4 mL aquades

4.      Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Protein

Diambil Larutan Standar 4 mg/mL, Dimasukkan ke dalam kuvet, Dimasukkanke dalam alat spektrofotometer UV-VisDiukur absorbansi pada panjang gelombang 520 nm

Diulangi langkah-langkah di atas untuk panjang gelombang 520-545 nm dengan interval 5 nm. Ditentukan panjang gelombang maksimum

5.  Membuat Kurva Kalibrasi Protein standar dan protein

Diambil larutan standar 0,5 mg/mL Dimasukkan ke dalam kuvet

Dimasukkan ke dalam UV-Vis Diukur nilai absorbansipada panjang gelombang maksimum (percobaan 4). Diulangi langkah di atas untuk larutan standar dengan konsentrasi 1, 2, dan 4 mg/mL. Dicatat nilai absorbansi

6.  Penentuan Konsentrasi Sampel

Diambil sampel A: Dimasukkan ke dalam kuvet, Dimasukkan ke dalam UV-Vi dan Diukur nilai absorbansipada panjang gelombang maksimum (percobaan 4)

Diulangi langkah di atas untuk sampel B

Dicatat nilai absorbansi

E.  Hasil Praktik Uji Kuantitatif Protein

1.        Menentukan Panjang Gelombang Maksimum

No	Panjang Gelombang λ (nm)	Absorbansi (A)
1	520	0,420
2	525	0,525
3	530	0,567
4	535	0,583
5	540	0,655
6	545	0,064

2.        Membuat Kurva Kalibrasi

No	Konsentrasi Larutan Standar (mg/L)	Panjang Gelombang (nm)	Absorbansi (A)
1	0,1	540	0,375
2	0,2		0,608
3	0.4		0,611
4	0,8		0,737

3.        Menentukan Konsentrasi Sampel

No	Sampel	Absorbansi (A)
1	X	0,581

A.  Analisis Sata Uji Kuantitatif Protein

1. Persamaan Reaksi
2. Panjang Gelombang Maksimum

No	Panjang Gelombang λ (nm)	Absorbansi (A)
1	520	0,420
2	525	0,522
3	530	0,567
4	535	0,583
5	540	0,655
6	545	0,645

Kurva Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Berdasarkan grafik di atas maka panjang gelombang maksimum untuk pengukuran sampel protein adalah 540 nm.

3. Kurva Standar

No	Konsentrasi Larutan Standar (mg/L)	Absorbansi(A)
1	0,1	0,375
2	0,2	0,608
3	0,4	0,611
4	0,8	0,737

Sehingga diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut:

4. Penentuan Konsentrasi Protein Sampel

Diketahui    : Absorbansi sampel protein A = 0,581 pada λ = 540 nm

                      Persamaan linear kurva kalibrasi: y = 1,1684x

Dengan mensubstitusikan nilai absorbansi cuplikan pada persamaan linearitas kurva kalibrasi sebagai nilai y, maka didapatkan nilai konsentrasi cuplikan sebagai nilai x:

                      y        = 1,1684x

                      x        =

                                =

                                = 0,4972 mg/L

Jadi, konsentrasi sampel protein setelah diencerkan adalah 0,4972 mg/mL.

F.  PEMBAHASAN

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer – monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor . Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam aminobagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof). Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida,lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia.Analisa protein dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu analisa kualitatif dan analisa kuantitatif. Pada praktikum ini, analisa protein dilakukan dengan menggunakan uji kuantitatif protein untuk mencari konsentrasi protein dengan uji biuret menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis.

Uji biuret dilakukan dengan tujuan untuk menentukan adanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida dalam sampel protein berdasarkan pengukuran serapan cahaya oleh ikatan. Prinsip dari analisis protein adalah pengukuran jumlah atau kadar N dalam bahan pangan dan reaksi spesifik suatu senyawa/reagen dengan ikatan peptida. Semakin tinggi kadar protein dalam sampel, jumlah ikatan peptida semakin banyak. Keunggulan dari metode ini adalah pengukuran kadar proein secara langsung (direct method), mendeteksi ikatan peptida protein secara spesifik, tidak mendeteksi nitrogen dari senyawa non peptida dan metode ini merupakan metode yang sederhana, cepat , dan murah (Maligan, 2014).

Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu. Reagen dalam uji biuret terdiri dari larutan CuSO₄ dan NaOH dengan perbandingan yang sama dan dicampurkan dalam sampel. Sampel yang digunakan adalah enzim yang merupakan suatu protein dengan ikatan peptida di dalamnya. Campuran dihomogenkan dan ditutup sebagai perlakuan inkubasi. Inkubasi ini bertujuan untuk mencegah terjadinya reaksi sehingga sampel tidak mencapai suhu biasa. Pada suhu rendah (4-10^oC) semua protein tidak mengalami degradasi.

Fungsi larutan NaOH agar sampel protein menjadi suasana alkalis. Suasana alkalis (basa) bertujuan agar reaksi dapat berjalan dengan cepat. Sedangkan larutan CuSO₄ akan membentuk kompleks berwarna ungu dari reaksi ion Cu²⁺/ kupri pada kondisi alkalisdengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida. Hasil menunjukkan sampel protein yang diuji positif mengandung ikatan peptida pada sampel yang ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna ungu karena mengandung zat albumin memiliki rumus bangun yang kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial sehingga terbentuk ikatan peptida. Reaksi yang terjadi:

Larutan ungu yang terbentuk akan berguna dalam analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Zat yang dapat dianalisis menggunakan alat ini adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tampak berwarna.Jika zat tersebut tidak berwarna maka perlu direaksikan dengan reagen tertentu sehingga dihasilkan suatu larutan berwarna.Larutan-larutan berwarna yang dianalisis menggunakan spektrofotometer UV tidak boleh ada partikel koloid ataupun suspensi. Karena adanya partikel-partikel koloid ataupun suspensi akan memperbesar absorbansi, akibatnya bila dihubungkan dengan rumus yang diturunkan dari hukum Lambert-Beer, konsentrasi zat yang dianalisis makin besar dan apabila digunakan untuk penentuan struktur suatu senyawa maka pita pada spektrum akan melebar dari yang sesungguhnya.

Analisis kuantitatif protein menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 520-545(interval 5 nm) untuk mendapatkan serapan maksimum. Spektrum UV-Vis dgunakan untuk senyawa organik yang berhubungan dengan transisi elektronik pada tingkat-tingkat energi elektron tertentu. Transisi itu biasanya menyangkut transisi elektronik bebas dan orbital yang tidak terisi pada non bonding atau orbital anti bonding. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap senyawa mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik. Bila cahaya mempunyai tenaga yang sama dengan perbedaan tenaga antara tingkatan dasar dan tenaga tingkatan tereksitasi jatuh pada senyawa maka elektron-elektron pada tingkatan dasar dieksitasi ke tingkat tereksitasi, dan sebagian tenaga dengan proses radiasi panas dan kembali ke tingkatan dasar (asal). Karena perbedaan tenaga antara tingkatan dasar dan tingkat tereksitasi spesifik untuk tiap-tiap bahan atau senyawa, maka frekuensi yang diserap juga tertentu. Gambar hubungan intensitas radiasi (absorbansi) sebagai frekuensi dikenal sebagai spectrum serapan (Sastroamidjojo, 2001: 9).

Komponen-komponen yang mengabsorpsi dalam spektrofotometri UV-Vis dapat berupa absorpsi oleh senyawa-senyawa organik maupun anorganik. Senyawa-senyawa organik yang mengandung ikatan rangkap 2 atau rangkap 3 akan menghasilkan puncak-puncak absorpsi yang penting terutama dalam daerah UV. Gugus-gugus fungsional organik tidak jenuh yang mengabsorpsi sinar tampak dan UV ini dinamakan kromofor atau sering dikenal dengan pembawa warna. Contoh kromofor, -NH2, -C=C-, C=O, -CHO, -NO2, -N=N- dan lain-lain. Sedangkan absorpsi oleh senyawa-senyawa anorganik, spektra dari hampir semua ion-ion kompleks dan molekul-molekul anorganik menghasilkan puncak absorpsi agak melebar. Untuk ion-ion logam transisi, pelebaran puncak disebabkan oleh faktor-faktor lingkungan kimianya. Suatu contoh larutan Cu (II) encer berwarna biru muda, tetapi warna akan berubah menjadi biru tua dengan adanya amonia. Bila unsur-unsur logam membentuk kompleks, maka faktor ligan sangat menentukan. Proses absorpsi ini kemudian dapat dijelaskan bahwa suatu molekul atau atom yang mengabsorpsi radiasi akan memanfaatkan energi radiasi tersebut untuk mengadakan eksitasi elektron. Eksitasi ini hanya akan terjadi bila energi radiasi yang diperlukan sesuai dengan perbedaan tingkat energi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi dan sifatnya karakteristik (Moersid, 1989: 33).

Dalam melakukan pengukuran menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis harus menggunakan larutan blanko sebagai pembanding. Larutan blanko adalah larutan yang berisi selain sampel yang akan diukur dapat berupa pelarut sampel tersebut. Larutan blanko diukur pada absorbansi nol agar larutan blanko tidak menyerap radiasi dari sinar. Pada praktikum ini larutan blanko berisi pereaksi biuret dan aquades yang akan meneruskan sinar pada daerah panjang gelombang yang digunakan tetapi tidak menyerap sinar.

Panjang gelombang maksimum dapat ditentukan pada dengan mengalurkan absorbansi terhadap panjang gelombang dari suatu larutan dalam deret standar yang dituangkan dalam bentuk kurva. Berdasarkan kurvatersebut maka panjang gelombang maksimum untuk pengukuran sampel protein adalah 545 nmdengan absorbansi sebesar 0,655. Hal ini karena absorbansi dari sampel protein yang paling tinggi terdapat pada panjang gelombang 540 nm. Dengan demikian penentuan absorbansi selanjutnya untuk konsentrasi yang berbeda ditentukan menggunakan panjang gelombang maksimum. Hal ini sesuai dengan (Janairo, dkk,  2011) yang menyatakan bahwa warna biru pada larutan protein dapat diamati pada 545 nm.

Penetuan panjang gelombang maksimum pada analisis dengan spektrofotometri Uv-Vis dilakukan untuk memperoleh sensitivitas maksimum. Hal ini sangat penting dilakukan karena pada panjang gelombang maksimum dihasilkan absorbansi tertinggi yang menunjukkan kepekaan suatu pengukuran sehingga dapat digunakan untuk analisis suatu larutan dengan konsentrasi rendah. Pada λmax itulah dapat diketahui adanya perubahan absorbansi yangtinggi pada tiap konsentrasi. Panjang gelombang itulah yang kemudian digunakan sebagai dasar pengukuran selanjutnya dan memberikan kepekaan analisis yang maksimumsehingga dihasilkan kesalahan yang kecil (Umaniyah, 2010).

Setelah mendapatkan panjang gelombang maksimum maka dapat ditentukan  konsentrasi sampel protein yaitu sampel A dan B melalui kurva kalibrasi yang mengalurkan hubungan antara nilai absorbansi dari masing-masing larutan standar terhadap konsentrasi (mg/mL).Kurva kalibrasi menurut Lambert-Beer seharusnya bentuk yang dihasilkan adalah bentuk linear tetapi berdasarkan analisis data diperoleh kurva yang tidak linear yang ditunjukkan dengan nilai R² = – 2,89. Membelokknya grafik menyebabkan konsentrasi protein terlalu pekat karena tidak dilakukan pengenceran sehingga mempengaruhi nilai absorbansinya.

Pada kurva kalibrasi antara absorbansi dengan konsentrasi menunjukkan persamaan linear dari kurva tersebut yaitu  :  y            = 1,1684x. Dengan mensubtitusikan nilai absorbansi cuplikan pada persamaan linearitas kurva kalibrasi sebagai nilai y,maka akan didapat nilai konsentrasi cuplikan sebagai nilai x dan menghasilkan konsentrasi sampel protein A dan B masing-masing sebesar 2 mg/mL.

Dalam analisis kuantitatif protein yaitu penentuan konsentrasi protein masih terdapat metode selain uji biuret diantaranya adalah :

a.       Metode Kjedahl

Metode kjedahl merupakan metode sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Metode kjedahl yaitu analisis protein kuantitatif protein tak langsung, penentuan protein kasar (crude protein). Pengukuran kadar N dalam bahan pangan dengan tahapan destruksi, destilasi, titrasi dan rumus yang digunakan untuk menghitung kadar protein adalah kadar N dikali faktor konversi, dimana faktor konversi adalah 100/16 (umum). Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia disuling dan ditetapkan secara titrasi (Sudarmadji, 1989). Kelemahan dari metode ini adalah senyawa lain selain protein yang mengandung N terukur sebagai protein. Sebagai contoh senyawa bernitrogen adalah asam amino bebas, urea, amonia, purin, pirimidin (Maligan, 2014).

Prinsip dasar yang sama masih digunakan hingga sekarang, walaupun dengan modifikasiuntuk mempercepat proses dan mencapai pengukuran yang lebih akurat. Metode ini masihmerupakan metode standart untuk penentuan kadar protein. Karena metode Kjeldahl tidakmenghitung kadar protein secara langsung, diperlukan faktor konversi (F) untuk menghitungkadar protein total dan kadar nitrogen. Faktor konversi 6,25 (setara dengan 0,16 g nitrogen per gram protein) digunakan untukbanyak jenis makanan, namun angka ini hanya nilai rata-rata, tiap protein mempunyai faktor konversi yang berbeda tergantung komposisi asam aminonya. Kerugian dari metode ini yaitu tidak memberikan pengukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam makanan bersumber dari protein. Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena susunan residu asam amino yang berbeda. Penggunaan asam sulfat pada suhu tinggi berbahaya, demikian juga beberapa katalis. Dan teknik ini membutuhkan waktu lama. Sedangkan keuntungan metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih merupakan metode standar dibanding metode lain. Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak digunakan untuk penetapan kadar protein.

b.      Metode Dumas Termodifikasi

Prinsip umumnya yaitu Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu tinggi (sekitar 900 ^oC) dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan CO₂, H₂O dan N₂. Gas CO₂dan H₂O dipisahkan dengan melewatkan gas pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungan nitrogen kemudian dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detektor konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan nitrogen dari sisa CO₂ dan H₂O.  Alat ini dikalibrasi dengan senyawa analis yang murni dan telah diketahui jumlah nitrogennya, seperti EDTA (= 9,59 %N). Dengan demikian sinyal dari detektor dapat dikonversi menjadi kadar nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen dalam sampel menjadi kadar protein, tergantung susunan asam amino protein. Keuntungannya adalah jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran, dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl). Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik, banyak sampel dapat diukur secara otomatis, dan mudah digunakan. Sedangkan kerugian adalah mahal, tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya karena tidak semua nitrogen dalam sampel berasal dari protein. Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena susunan asam amino yang berbeda. Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.

c.       Metode titrasi formol

Hitung % nitrogen asam amino dengan rumus :

Kadar protein merupakan konversi % nitrogen AA ke protein (x 6,25). Buat kurva hubungan lama waktu inkubasi vs % kadar protein.

d.      Metode Bradford

Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara kolorimetri dalam suatu  larutan.  Dalam  uji  Bradford  melibatkan  pewarna  Coomassie  Brilliant  Blue  (CBB)  yang  berikatan dengan  protein  dalam  suatu  larutan  yang  bersifat  asam  sehingga  memberikan  warna  (kebiruan).  Karena  menghasilkan  warna,  sehingga  secara  kolorimetri  dapat  diukur  absorbansinya  dengan  menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada panjang gelombang 465 dan 595 nm (cahaya tampak). Reagen  Bradforddibuat  dengan  cara  menimbang  0.01  g  coomasie  brilian  blue  (CBB)  G-250  yang kemudian  dilarutkan  dalam  5  ml  etanol  95%  (v/v),  lalu  ditambahkan  10  ml  asam  fosfor  85%  (v/v). Campuran  dihomogenkan  (dikocok  kuat)  lalu  disaring  dengan  kertas  saring  dan  disimpan  dalam botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan (Anam, 2010).

e.       Sejumlah metode UV- Vis

Penetapan kadar protein (termasuk uji biuret) yang menggunakan alat ini diantaranya yaitu pengukuran langsung pada 280 nm. Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya UV pada 280 nm. Kandungan tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan metode ini karena sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus. Sedangkan kerugian utamanya yaitu asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna. Namun demikian, metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain dengan pengukuran serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda.

Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteau phenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein.

Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar di sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah dibanding metode biuret. Hitung kadar protein (g/dL) :

Metode pengikatan pewarna menggunakan pewarna dengan muatan negatif (anionik) ditambahkan dalam jumlah berlebih pada larutan protein yang pH nya telah disesuaikan sehingga protein menjadi bermuatan positif (misalnya dibuat di bawah titik isoelektrik). Protein membentuk kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut.  Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine, arganine, dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan. Jumlah protein yang ada di larutan awal berhubungandengan jumlah pewarna yang terikat :

                                    [Pewarna terikat] = [Pewarna awal] – [Pewarna]

Metode Turbimetri terjadi pada molekul protein yang umumnya larutan dapat dibuat mengendap dengan penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).

G.      KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa uji biuret dapat digunakan untuk menetukan konsentrasi protein secara kuantitatif.prinsip metode biuret adalah reaksi protein dengan ion Cu2+ pada suasana basa yang menghasilkan warna ungu dan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometri UV-Vis yang diukur pada panjang gelombang maksimum yaitu 540nm. Persamaan yang didapat dari larutan standar adalah Y= 1,1684xsehingga dengan menggunakan  Hukum Lambert-Beer didapatkan konsentrasi protein pada sampel A dan B adalah sama yaitu sebesar 0,4972 mg/mL.

Demikian cara UJI KUANTITATIF PROTEIN Biokimia

Daftar Pustaka

• Anam, Khairul. 2010. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Bradford. Bogor : Institut Pertanian Bogor.
• Baker, D.H. 2009. Biochemistry Fourth Edition, Thomson Learning. Albert Complex, Singapore.
• Chang, Raymond. 2005. Kimia Dasar: Konsep-Konsep Inti. Jilid 2/Edisi Ke-3. Jakarta: Erlangga.
• Daintith, John. 2004. Kamus Kimia Lengkap. Jakarta : Erlangga.
• Janairo, Gerardo, dkk. 2011. Determination of the Sensitify Range of Biuret Test for Undergraduate Biochemistry Experiments. Philippines : Salle University.
• Maharani, Endang Triwahyuni. 2010. Kadar Protein Kista Artemia Curah yang Dijual Petambak Kota Rembang dengan Variasi Suhu Penyimpanan. Semarang : Universitas Muhammadiyah Semarang.
• Maligan, Jaya Mahar. 2014. Protein Analysis. Malang : Universitas Brawijaya.
• Mandle, Anil Kumar, dkk. 2012. Protein Structure Prediction Using Support Vector Machine. India : Technological Institute Vidischa.
• Moersid, Imam. 1989. Kimia Anorganik Bagian Senyawa Koordinasi. Semarang: IKIP Semarang Press.
• Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Suprayanti. 2007. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.
• Rusmawan, dkk. 2011. Analisis Kolorimetri Kadar Besi(III) dalam Sampel Air Sumur denganMetoda Pencitraan Digital. Bandung : Prosiding Simposium Nasional Inovasi Pembelajaran dan Sains 2011 (SNIPS 2011).
• Sastrohamidjojo, Hardjono. 2001. Spektroskopi.Yogyakarta: Liberty.
• Sudarmadji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta : Liberty.
• Suheryanto, Dwi. 2010. Optimalisasi Celupan Ekstrak Daun Mangga pada Kain Batik Katun Dengan Iring Kapur. Semarang UNDIP.
• Umaniyah, Lilik, dkk. 2010. Peningkatan Kualitas Kayu Intsia bijugadengan Adsorbsi Senyawa Kompleks Fe-SCN. Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh Nopember.
• Wulandari, Sri. 2005. Analisis Mikrobologi Produk Ikan Kaleng (Sardines) Kemasan Dalam Limit Waktu Tertentu (Expire). Pekanbaru: Universitas Riau.